می دانيم كه كروماتوگرافی روشی است برای شناسائی و جدا سازی و اندازه گيری مواد. HPLC يعنی كروماتوگرافی مايع با فشار زياد يا كروماتوگرافی مايع با كاركرد عالی است. HPLC از دو فاز ثابت و متحرک تشكيل شده است. كه فاز ثابت ممكن است جامد و يا مايع باشد و فاز متحرک مايع است. HPLC بدون شک ، سریع‌ترین رشد را در بین تمام روشهای جداسازی تجزیه‌ای با فروش سالیانه در گستره بیلیون دلار داشته است. دلایل این رشد انفجارآمیز عبارتند از حساسیت روش ، سازگاری سریع آن برای انجام اندازه‌گیری‌های کمی صحیح ، شایستگی آن برای جداسازی مواد گونه‌های غیرفرار یا ناپایدار در مقابل گرما و مهم تر از همه ، کاربرد گسترده آن برای موادی است که در صنعت ، زمینه‌های مختلف علوم و جامعه اهمیت درجه اول را دارند. مزیت کروماتوگرافی نسبت به ستون تقطیر این است که به آسانی می‌توان به آن دست یافت. با وجود اینکه ممکن است چندین روز طول بکشد تا یک ستون تقطیر به حداکثر بازده خود برسد، ولی یک جداسازی کروماتوگرافی می‌تواند در عرض چند دقیقه یا چند ساعت انجام گیرد.یکی دیگر از مزایای برجستة روشهای کروماتوگرافی این است که آنها آرام هستند. به این معنی که احتمال تجزیة مواد جداشونده به وسیله این روشها در مقایسه با سایر روشها کمتر است.مزیت دیگر روشهای کروماتوگرافی این است که تنها مقدار بسیار کمی از مخلوط برای تجزیه لازم است. به این علت، روشهای تجزیه‌ای مربوط به جداسازی کروماتوگرافی می‌توانند در مقیاس میکرو و نیمه میکرو انجام گیرند.
انتخاب بهترین روش کروماتوگرافی
انتخاب نوع روش کروماتوگرافی بجز در موارد واضح (مانند کروماتوگرافی گازی در جداسازی گازها) عموماً تجربی است. زیرا هنوز هیچ راهی برای پیش‌بینی بهترین روش برای جداسازی اجسام، مگر در چند مورد ساده وجود ندارد.
در ابتدا روشهای ساده‌تری مانند کروماتوگرافی کاغذی و لایه نازک امتحان می‌شوند. در صورتی که با این روشها مستقیماً قادر به جداسازی باشند، جداسازی را باید به وسیلة آنها صورت داد. در غیر این صورت، از روشهای پیچیده‌تر استفاده می‌شود.
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)، وقتی که روشهای ساده فاقد کارایی لازم هستند، می‌تواند جوابگو باشد. ولی دانشمندان دریافتند که بهترین نوع به خاطر دقیق تر بودن کروماتوگرافی ژلی است.
کارایی ستون HPLC
کار این ستون نیز به اندازه ذرات داخل ستون بستگی دارد. هرچه اندازه ذرات کوچک تر باشد، کارایی HPLC بیشتر می‌شود.
فاز ساکن و فاز متحرک
در مورد فاز‌های ساکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد و آن ، این است که باید قطبیت حل شونده و فاز متحرک ، نزدیک به هم باشد، ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد. ترتیب قطبیت گروههای عاملی در ترکیبات به صورت زیر است:
هیدروکربن< اترها < استرها < کتون‌ها < آلدئیدها < آمیدها < آمین‌ها < الکل‌ها
به عنوان مثال ، فاز ساکن با قطبیت بالا مثل سیلیکات یا آلومین یا مایعات قطبی مثل تری‌اتیلن گلیگول که روی ذرات سیلیکات قرار گرفته‌اند و فاز متحرک ، حلال نسبتا غیر قطبی مثل هگزان یا ایزو پروپیل اتر را می‌توان نام برد.
خصوصیات فاز متحرک ( HPLC )
- خلوص بالا
- نقطه جوش حدود 20 تا 50 بالاتر از دمای ستون
- گرانروی پایین
- واکنش پذیری کم
- قابلیت تطابق با آشکارساز
- سمیت و اشتعال پذیری کم
مزایای HPLC
کاربرد HPLC برای مواد غیر فرار به قرار زیر می‌باشد:از ستونهای طولانی که سرعت حلال در تمام طول آنها نزدیک به مطلوب‌ترین سرعت باشد، می‌توان استفاده کرد و امکان تغییر دادن ماهیت فاز متحرک برای انجام شستشوی تدریجی و شستشوی مرحله‌ای یا هر دو وجود دارد.
آشکارساز
آشکارسازهای مورد استفاده در کروماتوگرافی مایع - مایع تمام خصوصیات آشکارسازهای کروماتوگرافی گازی را دارند، بجز اینکه در آشکارساز کروماتوگرافی مایع نیازی به محدوده دمایی بالا نیست. این شناساگرها کلاً دو دسته‌اند:
- یک نوع کلی که به فاز متحرک عکس‌العمل نشان می‌دهند.
- نوع خاصی که به حل شونده حساس هستند.
کاربردهای HPLC
کاربرد گسترده آن برای موادی است که در صنعت ، زمینه‌های مختلف علوم و جامعه اهمیت درجه اول را دارند. مثال‌هایی از این موارد عبارت‌اند از : اسیدهای آمینه ، پروتئین‌ها ، اسیدهای نوکلئیک ، هیدروکربنها ، هیدراتهای کربن ، داروها ، ترپنوئیدها، حشره‌کش‌ها ، آنتی‌بیوتیکها ، استروئیدها ، گونه‌های آلی یا فلزی و گروهی از مواد گوناگون معدنی.
در دستگاه HPLC سیستم پیچیده تری نسبت به دیگر روشهای کروماتوگرافی وجود دارد. اغلب از ستونهای پر شده با ذرات ریز فاز ساکن استفاده می‌شود. به همین علت سطح بیشتری از فاز ساکن در ستون، در معرض اجزاء نمونه قرار می‌گیرد و در نتیجه راندمان جداسازی در این روش بیشتر از LSC و LLC است.
اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه HPLC
1- مخازن حلال: كه در آنها فاز متحرک و يا حلالهای شستشو دهنده ستون ريخته شده است.
2- موتور يا پمپ: چون ستونها نسبتا طويل و اندازه ذرات كم است. به اين جهت قابليت نفوذ كم می شود و برای اين كه حلال جريان داشته باشد بايد فشاروجود داشته باشد. برای ايجاد فشار از پمپ يا موتور استفاده می كنيم. پمپ فشاری حدود psi 4500 می تواند ايجاد كند. و بايد بتواند فشار ثابت ايجاد كند. حلال توسط پمپ با فلوی ثابتی بر روی فاز ثابت حركت داده می شود. حداكثر فلوئی كه فاز متحرک می تواند داشته باشد ml/min 2.5 است. و بسته به نوع كاری كه می خواهيم انجام دهيم فلو فرق می كند، هر چه فلو كمتر باشد، فاصله پيک ها بيشتر است. چهارمخزن داريم مخزنD, C, B, A ميزان فشار بستگي به فلوی ما دارد وقتي فلو ml/min 0.8 است ميزان فشار حدود psi 1500 می شود. ميزان فشار بستگی به نوع ستون دارد حداكثر فشار مجاز Psi 3500 است. حداكثر تغييرات فشار Psi 100 است. حداكثر فلوريت Flow rate ، ml/min 2.5 است. پس پمپ، حلال را از مخزن مي گيرد و با سرعت گذر ثابتی آن را بداخل دستگاه وارد می كند. در دمای آزمايشگاه به دو روش مي توانيم كار كنيم:
الف- روش ايزوكراتيک isocratic: اگر نسبت های مختلفی از فاز متحرک را در يک مخزن بريزيم و از همان مخزن فاز متحرک را برداشت كنيم از روش ايزوكراتيک استفاده كرده ايم. مثلا در کار عملی انجام شده درآزمایشگاه فاز متحرك( 80% بافر فسفات 12% متانول و 8% استونيتريل) است كه پس از صاف كردن همه را در يک مخزن مثل D می ريزيم و از همان مخزن پمپ برداشت می كند.
ب - روش گراديانت gradient :اجزاء فاز متحرک در مخازن مختلف ريخته می شود. دستگاه قابليت اين را دارد كه خودش نسبت های مختلف را از مخازن برداشت كند (طبق داده های ما)، مثلا می خواهيم ازمخزن A، 80% از مخزن B 8% و از مخزن C 12% بكشد. و بعد نسبت ها را مخلوط می كند. از اين روش وقتی استفاده می كنيم كه نسبت های موردنظر را نمی دانيم و بخواهيم روش کار پيدا كنيم. ولی وقتی درصد فاز متحرک برای ما روشن شد می توانيم از روش ايزوكراتيک استفاده كنيم. فاز متحرک با فلوی ثابتی بر روی ستون حركت داده می شود حداكثر فلو در این آزمایش ml/min0.8 يا 1 است. بعد از فعال كردن هر پمپ flow rate را از كم به زياد كم كم بالا می بريم تا حدود ml/min 0.8 يا 1 و می گذاريم حدود يک ربع ساعت يا نيم ساعت با فلوريت بالا كار كند و بعد فلوريت را به تدريج پايين می آوريم تا صفر و بعد پمپ را عوض می كنيم. يا دستگاه را خاموش می كنيم، فلوريت كه بالا برود فشار هم بالا مي رود. بعد از اتمام كار ستون را با حلالهای شستشو دهنده می شوئيم. حلالهاي شستشو را در مخازن ريخته و پمپ ها را به ترتيب فعال می كنيم اول دستگاه را با آب و متانول شسته و سپس با متانول خالص می شوئيم. هر پمپ را كه فعال كرديم بايد ابتدا هوا گیری کنیم.
تهيه بافرفسفات: 13.6 گرم از Po4H2K را وزن كرده (0.1M) و به حجم يک ليتر می رسانيم pH ، 4.5 می شود كه با اسيد فسفريک غليظ حدود يک دو قطره pH را به حدود 3.5 می رسانيم.
3- injector: از سرنگهای مختلف با ظرفيت های مختلف استفاده می كنيم. حجم تزريق 30 ميكروليتر است. نمونه ابتدا وارد قسمتی بنام گارد كالوم يا پری كالوم می شود كه محافظ ستون است، طول كاردكالوم حدو يک سانتی متر است. و جنس آن از فولاد ضد زنگ است، و ماده پركننده آن از جنس ماده پركننده ستون است. اگر ماده ما ناخالصی داشته باشد يا با ماده داخل ستون واكنش ايجاد كند درگاردكالوم انجام می شود و به ستون آسيبی نمی رسد.
4- ستون: طول ستونهای دستگاه حدود 30-10 سانتی متر است. و جنس آن از فولاد ضدزنگ است. پرمصرف ترين ستون C18 ، ODS آکتا دسيل سيلان است، ستونها را پس از اتمام كار بايد با محلولهای شستشو دهنده شست. اگر از بافرفسفات استفاده كرديم ستون را با آب و متانول و بعد با متانول خالص شستشو می دهيم. فاز ثابت بصورت ذرات ريزی در داخل ستون قرار گرفته است. كه بر اثر چسبيدن و پخش شدن اجزاء نمونه و عبور فاز متحرک جداسازی انجام می شود. نمونه ابتدا وارد گاردكالوم و بعد وارد ستون می شود، گارد كالوم را پس از مدتی بايد عوض كرد، ODS اكتا دسيل سيلان گروههای الكيل غيرقطبی زيادی دارد، فاز متحركی كه استفاده می كنيم قطبی است. فاز متحرک و ماده پركننده ستون از نظر قطبيت بايد عكس هم باشند. در HPLC امکان استفاده از فاز نرمال و معكوس هست. اگر فاز ثابت قطبی و فاز متحرک غيرقطبی باشد سيستم را فاز نرمال و در صورتي كه ستون غيرقطبی و حلال قطبی باشد. سيستم را فاز معكوس می گويند. مشتقات آلكيل سيلان و فنيل سيلان ايجاد ستونهای غير قطبی می كنند و معمولا ستون غير قطبی و فاز متحرک قطبی است بنابراين از فاز معكوس استفاده می شود. جنس ستونها از فولاد ضدزنگ يا Stainless steel است.
5- رديابها: رديابها بايد حساس باشند و اثر مخرب بر روی اجسام نداشته باشند. پاسخ آنها تا حدود وسيعی برای غلظت بايد خطی باشد. انواع رد یاب ها:
a -مهمترين آنها ردياب ماورا بنفش است که برای اجسامی كه در ناحيه UV-VIS جذب داشته باشند مورد استفاده قرار می گیرد.در اين دتكتور جذب انجام می شود و باعث كاسته شدن انرژی می شود كه اين كاسته شدن قابل اندازه گيری است.ميزان كاسته شدن انرژی متناسب است با غلظت،بايد طول موج را مشخص كنيم كه در اينجاnm l=225 است. حلال نبايد در طول موج انتخابی جذب داشته باشد.
.bردياب ضريب شكست، اين ردياب خيلی حساس به حرارت است.از تغييرات يا تفاوتی كه بين ضريب شكست سيستم حلال به تنهايی و سيستم حلال همراه نمونه ايجاد می شود استفاده می كنيم.
c. دتكتور فلورسانس حساس تر از UV است ولی كم مصرف می باشد چون موادی كه خاصيت فلورسانس داشته باشند كم هستند.
. dردياب الكتروشيميايي كه عملکرد آن بر مبنای واکنش های اکسید و احیا می باشد.
6- ثبات (ركوردر): در اثر حركات قلم پيک هایی رسم می شود كه به مجموعه آنها كروماتوگرام می گويند. به طريق كيفی پيک ها را براساس زمان باز داری يا نگهداری يا Retention time می شناسند. زمان بازداری فاصله زمانی از لحظه تزريق تا رسيدن به نقطه اوج يک پيک است. برای محاسبه كمی سطح هر نوار جذبی را حساب می كنيم، سطح هر نوار جذبی متناسب با مقدار جسم است كه بوسيله انتگراتور يا سطح سنج با دستگاه ثبات بدست مي آيد سطح هر نوار جذبی يعنی حاصلضرب قاعده × نصف ارتفاع است. روش بريدن نوار و وزن كردن آنها روش قديمی است. ولی امروزه توسط سطح سنج يا انتگراتور بدست مي آيد خود دستگاه AUC را مشخص مي كند. می توان از ارتفاع هم استفاده كرد و نسبت ارتفاع ها را مشخص كنيم AUC و ارتفاع با يک دستور ساده قابل تبديل بهم هستند. روش رسم منحنی را انجام می دهيم. در محور افقی غلظت ها و در محور عمودی AUC . بعد از رسم منحنی استاندارد، غلظت مجهول را از روی رسم منحنی بدست می آوريم.
